Vérification de pipettes à piston par méthode photométrique en cellule à écoulement

Vérification de pipettes à piston par méthode photométrique ratiométrique en cellule à écoulement

1. Instructions pour des volumes essais (V_U) de 2 à 10 µL

Les instructions qui suivent sont une adaptation de la norme ISO8655-7 et du rapport ISO/TR 16153.

1.1 Réactifs pour des volumes essais de 2 à 10 µL

- Solution mère de chromophore Ponceau S à 16,5 g/L. L'absorbance théorique, à 520 nm, en supposant la loi de Beer-lambert linéaire à l'infini est d'environ 752 pour un trajet optique de 1 cm. Le Ponceau S n'absorbe pas à 650 nm. En flacon protégeant de la lumière. En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Si préparation stérile, Conservation possible 1 mois au réfrigérateur (peut précipiter, resolubiliser par chauffage léger et homogénéisation).
- Tampon zéro et diluant : tampon phtalate 0,02 mol/L ajusté à pH 6,0 (4,08 g d'hydrogénophtalate de potassium et 13,3 mL de NaOH à 1 mol/L pour 1 litre). En eau dégazée. Solution filtrée à travers un filtre de porosité 0,2 µm. Le diluant n'absorbe ni à 520 ni à 730 nm. Si préparation stérile, conservation possible 1 mois au réfrigérateur.

1.2 Conditions sur la cellule d'écoulement et les solutions

La cellule ne devra absolument pas être déplacée pendant l'analyse.
En toute rigueur, il faudrait un ensemble qui permette de contrôler l'équilibration en température des solutions à 0,2°C près tout en garantissant l'absence totale de dégazage dans la cellule d'écoulement. Cette dernière condition est réalisée si la régulation de température permet de mesurer à plusieurs degrés en dessous de la température ambiante.

1.3 Réalisation de la solution étalon

Diluer exactement la solution de mère de Ponceau S avec le diluant selon : V₁ = 2 mL à la pipette jaugée deux traits de classe A de solution mère en fiole jaugée de 2 L de classe A (V_fj). Soit R le facteur de dilution, R = 1/1000. Homogénéiser (10 retournements). On peut flaconner en rinçant au préalable le flacon avec l'étalon. Il faut absolument boucher et éviter le plus possible toute évaporation. En cas de conservation, il faudra tenir compte de l'évaporation dans le budget d'incertitude. Il est fondamental d'utiliser de la verrerie jaugée de classe A de qualités métrologiques connues. Ainsi l'incertitude-type sur R sera connue. Il n'est pas recommandé de diminuer les volumes V₁ et V_fj car on augmente alors l'incertitude-type sur R et finalement sur V_U. Voici un lien qui ouvre sur les calculs d'incertitude. Où reprendre la présentation de la méthode en cellule d'écoulement dans le menu en haut à gauche.

1.4 Réalisation des solutions essais

Dans un tube parfaitement propre et sec : V_D= 5 mL de diluant à la pipette jaugée deux traits de classe A et V_U de volume essai avec la pipette mécanique. Homogénéiser (10 retournements). Boucher. Eviter le plus possible toute évaporation.

1.5 Mise à zéro du spectrophotomètre

L'idéal est de travailler avec un spectrophotomètre réalisant des mesures en mode multilongueurs d'ondes. Rincer la cellule d'écoulement avec le diluant. Régler le zéro pour 520 et 650 nm.

1.6 Absorbances de l'étalon et des essais

Mesurer l'absorbance de l'étalon à 520 et 650 nm. Soit A_S1 et A_S2 les absorbances obtenues.
Calculer l'absorbance de l'étalon A_S = A_S1-A_S2.
Note 1 : A_S1 est attendu aux environ de 1,5 et A_S2 aux environs de 0.
Note 2 : ce système de soustraction de l'absorbance à 650 nm où le Ponceau S n'absorbe pas permet de s'affrancfir des imperfections de zéro liées par exemple à de petites particules en suspension.
Mesurer l'absorbance des essais à 520 et 650 nm. Soit A_D1 et A_D2 les absorbances obtenues.
Calculer l'absorbance de l'étalon A_U = A_D1-A_D2.
Note 1 : A_D1 est attendu aux environ de 1,5 ou 0,75 ou 0,3 pour des volumes testés à 10 µL, 5 µL et 2 µL respectivement. A_D2 aux environs de 0.
Note 2 : ce système de soustraction de l'absorbance à 650 nm où le Ponceau S n'absorbe pas permet de s'affranchir des imperfections de zéro liées par exemple à de petites particules en suspension.
Attention au réglage de " durée " de la pompe de la cellule à écoulement : l'absorbance d'un échantillon ne doit pas être perturbé par l'échantillon précédent.

1.7 Calcul des volumes essais V_U

1.8 Apperçu des valeurs d'absorbance qu'on peut attendre


	Volume contrôlé en µL
Valeurs des aborbances	2	5	10
A_S	vers 0,75
A_U	vers 0,3	vers 0,75	vers 1,5

1.9 Incertitude-type composée sur V_U

Il faut utiliser le calcul d'incertitude-type composée comme présenté dans la page accessible par le menu en haut à gauche "Présentation : la méthode photométrique en cellule à écoulement".

L'idéal est d'avoir réalisé une feuille de calculs.
En voici une établie avec le tableur openoffice : incertitude-type composée contrôle p2-10 (.ods).
Et pour ceux qui ne veulent pas d'Openoffice (pourquoi ? essayez !) la version pdf, mais alors y'a pas d'accès aux formules ... incertitude-type composée contrôle p2-10 (.pdf) .

On peut retenir que entre 2 et 10 μL, selon le matériel utilisé, on obtient des incertitudes-types sur les volumes essais V_U vers 0,5% à 0,7%. Soit des incertitudes élargies (k=2, confiance 95%) vers 1 à 1,4%. Ce qui permet de vérifier des pipettes à piston avec des écarts maximum tolérés (EMT) à 5% (un EMT classique) de façon très satisfaisante.