Généralités concernant les méthodes photométriques pour les essais de volumes
Des méthodes photométriques
alternatives à la gravimétrie existent. Elles sont
très performantes pour les essais sur les petits volumes
de l'ordre du µL (par exemple pour vérifier des
pipettes à piston à des volumes vers 1 µL)
là où les méthodes gravimétriques
sont d'application très délicates
(nécessité de balances au µg et
difficultés pour gérer l'évaporation. Dans
ces méthodes, il s'agit en fait de mesurer des facteurs de
dilution par photométrie et de les relier au volume
inconnu soumis à l'essai. Pour être convenables, les
résultats obtenus doivent pouvoir être
associés à une détermination rigoureuse
d’incertitude : un calcul analytique d'incertitude-type
composée combinant les caractéristiques
métrologiques du spectrophotomètre utilisé,
les déviations à la loi de Beer-lambert, les effets
des variations de température, les caractéristiques
de la verrerie de classe A nécessaire …
Il existe deux méthodes photométriques
décrites dans la norme ISO 8655-7 :2005(F) et le rapport
technique ISO/TR 16153 :2004(F) :
• la méthode dite « en cellule
d'écoulement » (cuve à circulation) ;
• la méthode dite « à deux colorants et
changements de cuves ».
La méthode dite « en cellule d'écoulement » (cuve à circulation)
Deux réactifs sont nécessaires : une solution tampon phtalate pour réaliser les zéros d'absorbance et les dilutions, une solution mère de Ponceau S colorant qui absorbe à 520 nm et pas à 650 nm. Voici un schéma donnant le principe :
On utilise un spectrophotomètre à cuve à circulation à température régulée.
• Le zéro spectro est réalisé
à l'aide du tampon phtalate en mode double longueur d'onde à 520 et 650 nm.
• La solution mère de Ponceau est diluée R
fois à l'aide de verrerie jaugée de classe A, on
obtient la solution étalon dont on mesure l'absorbance
AS1à 520 nm (due au Ponceau) et l'absorbance
AS2à 650 nm (650 nm = λ à
laquelle le Ponceau S n'absorbe pas, ceci permettra de
s'affranchir des imperfections liées par
exemple à de petites particules en suspension).
• Un volume VD de diluant est introduit dans un
tube. Le volume VU essai est introduit sous forme de
solution mère dans le volume VD de diluant.
Après homogénéisation, on mesure
l'absorbance AD1à 520 nm et
l'absorbance AD2à 650 nm (a priori nulle sauf
imperfections de diffusion).
• L'analyse des absorbances obtenues permet de calculer
VU.
La formule est la suivante :
Avec AS=AS1-AS2 et |
- R : dilution de la solution mère avec le diluant pour
créer l'étalon |
Même si la démonstration de la formule ne vous
intéresse pas, il faut avoir à l'esprit
l'intérêt de ce mode opératoire en
cellule à circulation :
- il permet de ne pas avoir à tracer la concentration
exacte de la solution mère ni d'avoir à
connaître la valeur du coefficient d'absorbance
spécifique ;
- il compense les imperfections éventuelles de diffusion
;
- il fait abstraction de la longueur exacte de trajet optique de
la cuve à écoulement.
Ainsi si on travail avec de la verrerie jaugée raccordée, une température aux variations évaluées, avec un spectrophotomètre aux qualités métrologiques raccordées et dont la non-linéarité dynamique sur le protocole aura été évaluée, on pourra réaliser un calcul excat d'incertitude-type composé sur le volume. La méthode est raccordée.
2. Détermination de l'incertitude-type composée sur les volumes essais (VU)
La méthode proposée n'a de sens que si elle est raccordée aux étalons internationaux et qu’on peut estimer l'incertitude composée sur le volume VU (il faut aussi que l’incertitude soit faible devant les spécifications).L'incertitude-type composée sur les mesurages VU est déterminée en utilisant la loi de propagation des incertitudes-types. Elle exige de dériver la formule donnant VU selon tous les paramètres pouvant entraîner des incertitudes : linéarité de réponse combinée de l’ensemble spectrophotomètre/colorants, fidélité en absorbances du spectrophotomètre, dérive en longueur d'onde du photomètre, incertitudes sur la verrerie utilisée pour réaliser R et VD, variations de températures, imperfection des homogénéisations, incertitude du pH exact du diluant et problèmes d'évaporation. On peut alors calculer une incertitude composée élargie. Et comme on verra qu'on aura uniquement des variables indépendantes, la forme de la loi de propagation des incertitudes-types se résumera à :
u(y(x1,x2, ...xi... xn))  |
• u(y) : incertitude-type composée ; |
(cliquer ici pour avoir accès aux différentes composantes d'incertitude et aux dérivées partielles)
Une fois les différents ci et u(xi) connus (selon le lien ci-dessus), il suffit alors d'appliquer la formule du tableau ci-dessus pour obtenir l'incertitude-type sur le volume essai VU. L'idéal est de travailler avec une feuille de calculs.
En voici une établie avec le tableur openoffice : incertitude-type composée contrôle p2-10 écoulement (.ods).
Et pour ceux qui ne veulent pas d'openoffice (pourquoi ?) la version pdf, mais alors y'a pas d'accès aux formules ... incertitude-type composée contrôle p2-10 écoulement(.pdf) .
On peut retenir que vers 1 μL, selon le matériel utilisé, on obtient des incertitudes-types sur les volumes essais VU vers 0,5% à 0,7%. Soit des incertitudes élargies (k=2, confiance 95%) vers 1 à 1,4%. Ce qui permet de vérifier des pipettes à piston avec des écarts maximum tolérés (EMT) à 5% (un EMT classique) de façon très satisfaisante.