Généralités concernant les méthodes photométriques pour les essais de volumes
Des méthodes photométriques
alternatives à la gravimétrie existent. Elles sont
très performantes pour les essais sur les petits volumes
de l'ordre du µL (par exemple pour vérifier des
pipettes à piston à des volumes vers 1 µL)
là où les méthodes gravimétriques
sont d'application très délicates
(nécessité de balances au µg et
difficultés pour gérer l'évaporation. Dans
ces méthodes, il s'agit en fait de mesurer des facteurs de
dilution par photométrie et de les relier au volume
inconnu soumis à l'essai. Pour être convenables, les
résultats obtenus doivent pouvoir être
associés à une détermination rigoureuse
d’incertitude : un calcul analytique d'incertitude-type
composée combinant les caractéristiques
métrologiques du spectrophotomètre utilisé,
les déviations à la loi de Beer-lambert, les effets
des variations de température, les caractéristiques
de la verrerie de classe A nécessaire …
Il existe deux méthodes photométriques
décrites dans la norme ISO 8655-7 :2005(F) et le rapport
technique ISO/TR 16153 :2004(F) :
• la méthode dite « en cellule
d'écoulement » (cuve à circulation) ;
• la méthode dite « à deux colorants et
changements de cuves ».
La méthode dite « à deux colorants et changements de cuves »
1. Le principe détaillé et le calcul du volume essai
Trois réactifs sont nécessaires : une solution tampon phtalate pour réaliser les zéros d'absorbance, une solution mère de Ponceau S colorant qui absorbe à 520 nm et pas à 730 nm, un diluant en tampon phtalate et contenant un chromophore cuivrique qui absorbe à 730 nm et pas à 520 nm. Le diluant joue un rôle d'étalon interne, cette méthode à 2 "colorants" permet de s'affranchir des disparités entre cuves pour photométrie (différences de trajet optique et légères imperfections). Voici un schéma donnant le principe :
• Le zéro spectro est réalisé
à l'aide d'une cuve C1 chargée en tampon
phtalate.
• La solution mère de Ponceau est diluée R
fois à l'aide de verrerie jaugée de classe A, on
obtient la solution étalon dont on mesure l'absorbance
AS1à 520 nm (due au Ponceau) et l'absorbance
AS2à 730 nm (due au chromophore cuivrique du
diluant). Et ce dans la cuve C1.
• Un volume VD de diluant est introduit dans une
cuve C2. On mesure l'absorbance AD1à 520 nm (a
priori nulle sauf imperfections de zéro de cuve) et
l'absorbance AD2à 730 nm (due au chromophore
cuivrique du diluant).
• Le volume VU essai est introduit sous forme de
solution mère dans le volume VD de diluant.
Après homogénéisation, on mesure
l'absorbance AUà 520 nm (due au Ponceau).
• L'analyse des absorbances obtenues permet de calculer
VU.
La formule est la suivante :
 |
- R : dilution de la solution mère avec le diluant pour
créer l'étalon |
Même si la démonstration de la formule ne vous
intéresse pas, il faut avoir à l'esprit
l'intérêt de ce mode opératoire à deux
longueurs d'onde :
- il permet de ne pas avoir à tracer la concentration
exacte de la solution mère (ni du diluant et du tampon
évidemment) ni d'avoir à connaître les
valeurs des coefficients d'absorbance spécifique ;
- il compense les imperfections lors des "zéros";
- il fait abstraction des longueurs exactes de trajet optique des
cuves.
Ainsi si on travail avec de la verrerie jaugée raccordée, une température de laboratoire aux variations connues, avec un spectrophotomètre aux qualités métrologiques raccordées et dont la non-linéarité dynamique sur le protocole aura été évaluée, on pourra réaliser un calcul excat d'incertitude-type composé sur le volume. La méthode est raccordée.
2. Détermination de l'incertitude-type composée sur les volumes essais (VU)
La méthode proposée n'a de sens que si elle est raccordée aux étalons internationaux et qu’on peut estimer l'incertitude composée sur le volume VU (il faut aussi que l’incertitude soit faible devant les spécifications).L'incertitude-type composée sur les mesurages VU est déterminée en utilisant la loi de propagation des incertitudes-types. Elle exige de dériver la formule donnant VU selon tous les paramètres pouvant entraîner des incertitudes : linéarité de réponse combinée de l’ensemble spectrophotomètre/colorants, fidélité en absorbances du spectrophotomètre, dérive en longueur d'onde du photomètre, incertitudes sur la verrerie utilisée pour réaliser R et VD, variations de températures, imperfection des homogénéisations, incertitude du pH exact du diluant et problèmes d'évaporation. On peut alors calculer une incertitude composée élargie. Et comme on verra qu'on aura uniquement des variables indépendantes, la forme de la loi de propagation des incertitudes-types se résumera à :
u(y(x1,x2, ...xi... xn))  |
• u(y) : incertitude-type composée ; |
(cliquer ici pour avoir accès aux différentes composantes d'incertitude et aux dérivées partielles)
Une fois les différents ci et u(xi) connus (selon le lien ci-dessus), il suffit alors d'appliquer la formule du tableau ci-dessus pour obtenir l'incertitude-type sur le volume essai VU. L'idéal est de travailler avec une feuille de calculs.
En voici une établie avec le tableur openoffice : incertitude-type composée contrôle p2-10 (.ods).
Et pour ceux qui ne veulent pas d'openoffice (pourquoi ?) la version pdf, mais alors y'a pas d'accès aux formules ... incertitude-type composée contrôle p2-10 (.pdf) .
On peut retenir que vers 1 μL, selon le matériel utilisé, on obtient des incertitudes-types sur les volumes essais VU vers 0,5% à 0,7%. Soit des incertitudes élargies (k=2, confiance 95%) vers 1 à 1,4%. Ce qui permet de vérifier des pipettes à piston avec des écarts maximum tolérés (EMT) à 5% (un EMT classique) de façon très satisfaisante.