Electrophorèse des protéines en
présence de sodium dodécylsulfate (SDS) sur gel de
polyacrylamide = Electrophorèse SDS-page des
protéines
Le principe en quelques lignes
1. Première phase, dénaturation des protéines sous forme de micelles SDS-unités polypeptidiques de densités de charges identiques
En présence de 2-mercaptoéthanol + chaleur + SDS, toutes les sous unités polypeptidiques des protéines perdent leurs ponts disulfures éventuels, sont séparées, sont dénaturées et forment des micelles SDS - sous unité polypeptidique. Toutes les micelles présentent alors la même densité de charge (rapport charge q sur le rayon hydrodynamique r).
- Si on se souvient que le squelette carboné "déroulé" des polypeptides est globalement hydrophobe ;
- si on se souvient que le sodium dodécylsulfate est un détergent qui comprend une tête polaire sulfate hydrophile chargée négativement et une chaîne hydrophe apolaire de 12 carbone
- si on prend en compte l'action dénaturante des températures élevées sur les protéines
-
Alors la formation des micelles SDS-unités polypeptidiques est claire : le squelette globalement hydrophobe polypeptidique va être recouvert par le SDS tensioactif.
Le 2-mercaptoéthanol
(HO-CH2CH2-SH = RSH )se comporte en
réducteur des ponts disulfures éventuels :
( 2 R-SH en excès + X-S-S-X --> R-S-S-R + X-SH HS-X).
Ceci permet d'assurer une densité de charge constante des
micelles même pour des unités polypeptidiques
comportant des ponts disulfures).
Soit, par exemple, une protéine
formée par l'assemblage de 4 sous unités
polypeptiques, 2 unités symbolisées par 
et 2 unités symbolisées par
. La "chaîne rouge"
possède des ponts disulfures (-S-S-) symbolisés par
des traits noirs. Soit 
symbolisant
le SDS.
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| + 2-mercaptoéthanol en excès + température vers 100°C |
Chaque unité polypeptidique est isolée, dénaturée, réduite, sous forme de micelle SDS-unité. Toutes les micelles ont la même densité de charge. |
Ce sont les micelles ainsi obtenues qui vont être séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide. Comme toutes les micelles ont la même densité de charge et donc la même mobilité potentielle en veine liquide, c'est l'effet de tamisage moléculaire par le support gel qui sera mis en oeuvre pour exercer l'effet séparatif différentiel. Ce qui suppose donc de travailler avec un gel de porosité adaptée et parfaitement contrôlée ou avec un gel présentant un gradient de porosité.
2. L'étape de séparation électrophorétique
Dans la partie séparative du gel d'électrophorèse (separating gel), les grosses micelles sont plus freinées et/ou arrêtées par le maillage du gel que les petites micelles. D'où un profil de migration du type :
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Pour une porosité de gel donnée |
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- Ln(MM) : ln de la masse moléculaire d'une
unité polypeptidique (non glycosylée). - d : distance parcourue dans le gel d'électrophorèse (souvent on travaille relativement à un colorant de densité de charge très élevée utilisé comme marqueur). - Me : au dessus de cette masse moléculaire d'unité polypeptidique, les micelles sont arrêtées par le maillage du gel - Ma et Mb : dans cet intervalle de masses moléculaires, la migration est une fonction linéaire du logarithme de la masse moléculaire : d = a * Ln(MM) + b. |
3. Révélations des électrophorèses
On fixe (préciptation in situ, en général par une acidification) et on colore avec un colorant des protéines : bleu de Coomassie, méthodes aux sels de cuivre, au nitrate d'argent ...
Après transfert (technique dite Western blot) sur une membrane, on révèle sélectivement certains polypeptides en utilisant des anticorps marqués