Description de principe de la technique classique du Western blot

Sous forme d'un schéma présentant les 4 étapes.

L'étape de séparation électrophorétique est presque toujours une SDS-PAGE (électrophorèse en gel de polyacrylammide en présence de SDS en conditions dénaturantes), mais une électrophorèse 2D est possible... En général les échantillons sont des extraits cellulaires complexes.

La détection immunochimique implique le transfert des protéines séparées par électrophorèse sur une membrane adaptée (nitrocellulose ou PVDF, polyfluorure de vinylidène, PolyVinyliDene Fluoride). Aujourdh'hui presque tous les transferts sont réalisés par "électrotransfert" (electroblotting): un champ électrique entraîne le mouvement des protéines depuis le gel d'électrophorèse vers la membrane. Mais il existe des techniques par diffusion ou utilisation de la capillarité aidée par un vide partiel.

Les révélations directes sont rares (en révélation directe l'anticorps dirigé contre la protéine à révéler est aussi le conjugué à l'origine du signal). Les révélations dites indirectes, donc avec un anticorps primaire non marqué et un anti-anticorps conjugué donnant le signal sont la règle.

Les signaux donnés par les conjugués actuels sont de 2 types : émission de fluorescence ou chimiluminescence. En chimiluminescence, on utilise des anticorps conjugués avec de la peroxydase. La peroxydase catalyse une réaction entre du peroxyde d'hydrogène et un composé organique qui conduit à un produit d'oxydation excité, lequel se désexcite avec émission de lumière dont l'intensité est mesurée. En fluorescence, les marquages préférés utilisent des fluorochromes avec fluorescence dans le proche infrarouge.

 

Note. En technique dite du "dot blot", on adsorbe les protéines de l'échantillon sur une membrane sans séparation préalable (sans électrophorèse préalable). Par exemple par simples dépôts (les "dots", = les points en français) sur la membrane associés à une légère aspiration sous vide partiel. La détection est ensuite similaire à celle pratiquée en western blot, une immunodétection.

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